RAPD, AFLP JA RFLP
RAPD ja AFLP - nende meetodite suureks plussiks on see, et eelteadmisi uuritavate genoomide nukleotiidse järjestuse kohta pole vaja. Põhinevad PCR meetodil ja kasutada saab nn totaalset genoomset DNAd.
RAPD e. juhuslikult amplifitseeritud polümorfne DNA on lihtsam meetod, kus praimeriteks valitakse juhuslikud 10-nukleotiidsed oligod (igas proovis üks, võimalikke umbes miljon) ja fragmendid tekivad, kui praimerite seostumissaidid juhtuvad olema üksteisele suhteliselt lähedal (u 1000 np kaugusel) ja suunduvad teineteise poole. PCR tulemusena saadud lõigud lahutatakse geelelektroforeesil.
Piisavalt paljude praimerite kasutamisel eristuvad liigid, liigisisesed populatsioonid või isegi indiviidid. Nõrk koht on proovi saastumise (näiteks parasiidi või soolebakteri DNAst saadud tulemus) võimalus ja kriitiline algkogus. Samuti see, et homo – ja heterosügoodid pole lahutatavad, nn dominantne marker.
Piisavalt paljude praimerite kasutamisel eristuvad liigid, liigisisesed populatsioonid või isegi indiviidid. Nõrk koht on proovi saastumise (näiteks parasiidi või soolebakteri DNAst saadud tulemus) võimalus ja kriitiline algkogus. Samuti see, et homo – ja heterosügoodid pole lahutatavad, nn dominantne marker.
AFLP e. amplifitseeritud fragmentide pikkuspolümorfismi puhul lõhutakse DNA kahe restriktsiooniensüümiga eri pikkusega lõikude seguks. Tekkinud fragmentide otstesse kleebitakse linkerid.
Linkerjärjestusi ja juhuslikke (harilikult 1-3 nukleotiidi, 3’-otsas) nukleotiide sisaldavate PCR praimeritega selekteeruvad välja sellised fragmendid, mille esimesed nukleotiidid langevad kokku praimerisse valitud juhuslike nukleotiididega. Tulemus nähtav fragmentide mustrina agaroos-geelelektroforeesil või automaatanalüsaatoris (Joon. 15). Kuigi meetod on komplitseeritum kui RAPD, AFLP tulemused on paremini korratavad. Miinuseks see, et ei saa eristada homo-ja heterosügoote. |
Joonis 15. AFLP fragmentide elektroforegramm.
Allikas Wikipedia |
RFLP e. restriktsioonifragmentide pikkuspolümorfism on meetod (Joon.16), mille puhul on uuritava piirkonna järjestus juba eelnevalt välja selgitatud ja selle järjestuse alusel on varieeruvas lõigus muutuva nukleotiidi avastamiseks välja valitud restriktsiooniensüüm (või mitu ensüümi), mis mutatsiooni esinemisel jätavad DNA-ahela katki lõikamata või vastupidi lõikavad seda. Nii moodustub ebatavaline fragmentide muster, mille saab "tõlkida" DNA järjestuseks. Selliste muutuste kogumit nimetatakse haplotüübiks, geograafiliste isolaatide ja inbriidsete liinide uurimisel ökotüübiks.
RFLP puhul on mingis mõttes tegemist kiire ja üsna odava sekveneerimisega. Uuritav lõik paljundatakse PCR-i meetodiga ja seejärel lõigatakse ensüümi(de)ga. Fragmentide segu lahutatakse agaroosgeelelektroforeesil. RFLP animeeritud selgitus avaneb sellelt lingilt. Puuduseks on siin see, et avastamata jäävad järjestuse muutused, mis on tekkinud väljaspool restriktsioonisaite. |
Joonis 16. Erinevate liikide DNA ökotüüpide tekkimine ja RFLP mutatsiooniline päritolu. Ühel indiviidil on restriktsiooniensüümi EcoRI sait muteerunud ja ensüüm ei lõika, alles jääb üks suur fragment, mis eristub teisel indiviidil tekkivast kahefragmendilisest mustrist.
Allikas: Geneetika (2012) lk. 334. |