VALGUPÕHISED MARKERID
VALKUDE POLÜMORFISM. Ajalooliselt kõige vanemad molekulaarsed markerid on allosüümid. Allosüümideks nimetatakse ühe ja sellesama ensüümi variante, mida kodeerib sama lookus, kuid mis liiguvad elektororeesil erinevalt. Väga tundlik proovide käsitsemise suhtes, kuivõrd tegemist ensümaatilise aktiivsuse mõõtmisega. Metaboolsete markerite suurim puudus on see, et paljud valgud ekspresseeruvad ainult mingites kindlates kudedes.
Teisteks puudusteks on töö-ja ressursimahukus (Joon.18) ning tõsiasi, et kaugeltki mitte kõik valkudes toimunud muutused ei muuda nende käitumist elektriväljas ja seega jääb mingi hulk sündmusi märkamata.
Teisteks puudusteks on töö-ja ressursimahukus (Joon.18) ning tõsiasi, et kaugeltki mitte kõik valkudes toimunud muutused ei muuda nende käitumist elektriväljas ja seega jääb mingi hulk sündmusi märkamata.
Joonis 18. Valkude eraldamine kudedest ja elektroforees - koetükikeste kogumine, homogeniseerimine, tahke ja vedela fraktsiooni lahutamine, geeli valamine ja elektroforees, geeli värvimine, bändide hindamine.
Allikas: An Introduction to Molecular Ecology (2006), T.J.C. Bebee and G. Rowe.
VALKUDE PROFILEERIMINE. Mitmel erineval viisil valkude lahutamine ja proovide omavaheline võrdlemine.
Proovide esmane käsitsemine pole nii kriitiline, sest valgud denatureeritakse, kuid samas, kui valgud on detergendiga kaetud, siis pole lookuse alleelsete variantide eristamine enam võimalik. |
IMMUNOLOOGILISED MEETODID. Väga spetsiifilised ja tundlikud meetodid, kuid eeldavad rohkelt eelteadmisi ja on ka kulukad. Kasutatakse nii monokloonseid kui polükloonseid antikehi.
Keskkonnaproovide puhul kasutatakse bakteri pinnavalkude ELISAt (enzyme-linked immunosorbent assay). Uuritavad proovid, milles antigeene (AG) otsitakse, seotakse ELISA plaadile, edasi lisatakse antikehalahus, antigeen-antikeha seostumise korral tekib tugev side, mitteseostumise korral pestakse antikeha (AK) järgnevas etapis maha. Edasi lisatakse teine AK (eelmise antikeha-vastane antikeha), mille küljes on värvusreaktsiooni substraat ja kui eelmise reaktsiooni käigus on AG antikehaga seostunud, siis nüüd tekib selles topsis värvusreaktsioon. Kus seostumist pole, seal värvusreaktsiooni ei teki. Värvusreaktsiooni tugevus väljendab proovis sisalduva antigeeni hulka.
Sarnase tulemuse saab ka siis, kui fluorestseeruva värviga seostatakse puhastatud antikehad ja keskkonnaproovide skriinimisel AK-AG (näiteks bakteri pinnamarker) seostumise järgselt on mingid bakterid (nende pinnamarkerite põhjal) fluorestsentsmikroskoobis tuvastatavad.
Analoogse, kuid veelgi informatiivsema tulemuse saab Western-blotiga, mille lõpuks selgub lisaks antigeeni molekulmass ja see, kas tegu on ühe või mitme antigeeniga.
Seoses DNA-meetodite võidukäiguga jäi valgumeetodite arendamine mingil perioodil tagaplaanile, kuid tehnoloogia täiendamine on ka selles valdkonnas palju uusi võimalusi avanud, eriti seoses kliimamuutuse ning sellest tulenevate organismide adaptatsioonide ja ekspressioonimustritega.
Keskkonnaproovide puhul kasutatakse bakteri pinnavalkude ELISAt (enzyme-linked immunosorbent assay). Uuritavad proovid, milles antigeene (AG) otsitakse, seotakse ELISA plaadile, edasi lisatakse antikehalahus, antigeen-antikeha seostumise korral tekib tugev side, mitteseostumise korral pestakse antikeha (AK) järgnevas etapis maha. Edasi lisatakse teine AK (eelmise antikeha-vastane antikeha), mille küljes on värvusreaktsiooni substraat ja kui eelmise reaktsiooni käigus on AG antikehaga seostunud, siis nüüd tekib selles topsis värvusreaktsioon. Kus seostumist pole, seal värvusreaktsiooni ei teki. Värvusreaktsiooni tugevus väljendab proovis sisalduva antigeeni hulka.
Sarnase tulemuse saab ka siis, kui fluorestseeruva värviga seostatakse puhastatud antikehad ja keskkonnaproovide skriinimisel AK-AG (näiteks bakteri pinnamarker) seostumise järgselt on mingid bakterid (nende pinnamarkerite põhjal) fluorestsentsmikroskoobis tuvastatavad.
Analoogse, kuid veelgi informatiivsema tulemuse saab Western-blotiga, mille lõpuks selgub lisaks antigeeni molekulmass ja see, kas tegu on ühe või mitme antigeeniga.
Seoses DNA-meetodite võidukäiguga jäi valgumeetodite arendamine mingil perioodil tagaplaanile, kuid tehnoloogia täiendamine on ka selles valdkonnas palju uusi võimalusi avanud, eriti seoses kliimamuutuse ning sellest tulenevate organismide adaptatsioonide ja ekspressioonimustritega.