GEELELEKTROFOREES
Geelelektroforees on nn. molekulaarsesse sõela sisestatud laenguga osakeste, näiteks DNA fragmentide, üksteisest eraldamine elektriväljas.
Lihtsam meetod on agaroosgeelelektroforees, mille käigus valatakse ühtlane ja õhuke agaroosgeelikiht spetsiaalsesse vormi. Pärast geeli tardumist asetatakse see elektroodidega piiratud puhvrivanni ja uuritav DNA (ehk ensüümiga lõigatud DNA fragmentide segu ja DNA-ga seostuv värv) kantakse pipetiga geeli ühes servas paiknevatesse kambritesse („hammastesse”) Foto 3. Lülitatakse sisse elektrivool ja proovid jäetakse vooluvälja mõneks ajaks „jooksma”. Negatiivse laenguga DNA liigub positiivse pooluse suunas nii, et väiksemad (väiksema kogulaenguga) fragmendid kiiremini eespool ja pikemad (suurema kogulaenguga) aeglasemalt tagapool. Eraldunud fragmendid muutuvad UV-valguses nähtavaks, selleks värvitakse geeli eelnevalt UV-tundliku DNA-ga seostuva värviga, näit. etiidiumbromiidiga. Siin kõrval Fotol 4 on näide must-toonekure (Ciconia nigra) soomääramisest: esimesel rajal pikkusmarker, edasi emane lind, kaks isast, kolm emast, üks isane jne.
Lindudel (ka osadel putukatel, kaladel, roomajatel jt.) on emane heterogameetne (ZW) ja isane (ZZ) homogameetne sugupool. Sellest tingitult on emase linnu proovis näha sarnast fragmenti kui on isase linnu proovis, aga ka teist, kiiremini liikuvat ja ainult emasele linnule iseloomulikku, väiksemat fragmenti. Hele jälg, mis on kõikides foreesiradades nähtav (v.a. markeril) annab märku sellest, et neis proovides on DNA küllaltki lagunenud. GE animatsioonilink. |
Foto 4: Agaroos-geelelektroforeesi pilt linnu soomääramise PCR-ist. Kahe taustast eristuva fragmendiga isendid on emased ja ühe fragmendiga isased linnud. (Foto: K.Kaldma)
|
Polüakrüülamiidgeelelektroforees (PAGE) põhineb teistsugusel keemial ja on komplitseeritum, kuid eelmisega põhimõtteliselt sarnane protsess. Seda kasutatakse suuremat lahutuvust nõudvate (väiksemate) molekulide ja valkude lahutamiseks.
Seda meetodi kasutades on palju võimalusi uuritavate molekulide konformatsiooni säilitamiseks või "lahtiharutamiseks". Kasutatakse kas võimalikult loomulikke või hoopis denatureerivaid tingimusi, leiutatud on ridamisi erinevaid puhvrisüsteeme, samuti on valida suure hulga võimaluste vahel, kuidas geelis lahutatud molekule värvida. Tuntumad värvid on Coomassie briljantsinine, samuti etiidiumbromiid ja hõbe. Värvimise asemel või selle järgselt võib edasi minna ka Western blotiga.
Seda meetodi kasutades on palju võimalusi uuritavate molekulide konformatsiooni säilitamiseks või "lahtiharutamiseks". Kasutatakse kas võimalikult loomulikke või hoopis denatureerivaid tingimusi, leiutatud on ridamisi erinevaid puhvrisüsteeme, samuti on valida suure hulga võimaluste vahel, kuidas geelis lahutatud molekule värvida. Tuntumad värvid on Coomassie briljantsinine, samuti etiidiumbromiid ja hõbe. Värvimise asemel või selle järgselt võib edasi minna ka Western blotiga.