PCR
PCR ehk polümeraasi ahelreaktsiooni mõtles 1983. aastal välja Kary Mullis ja hetkel on see kindlasti kõige enam kasutatav meetod bioloogias ja biomeditsiinis.
Varasemal ajal oli paljudel juhtudel uurimistööd piirav faktor DNA vähesus ja PCR-i geniaalne idee seisneb uuritava (mitte juhusliku) DNA-piirkonna kiirel ja paljukordsel kopeerimisel.
Sama protsess, mis enne PCR-i leiutamist võttis aega mitmeid päevi (bakterisse kloneerimine, rakkude kasvatamine, DNA mitmekordne eraldamine, kontrollimine jne.) või millest algmaterjali vähesuse tõttu (haruldane või hävinud liik) tuli loobuda, toimub nüüd mõne tunniga.
Varasemal ajal oli paljudel juhtudel uurimistööd piirav faktor DNA vähesus ja PCR-i geniaalne idee seisneb uuritava (mitte juhusliku) DNA-piirkonna kiirel ja paljukordsel kopeerimisel.
Sama protsess, mis enne PCR-i leiutamist võttis aega mitmeid päevi (bakterisse kloneerimine, rakkude kasvatamine, DNA mitmekordne eraldamine, kontrollimine jne.) või millest algmaterjali vähesuse tõttu (haruldane või hävinud liik) tuli loobuda, toimub nüüd mõne tunniga.
Joonis 12. PCR-meetod DNA paljundamiseks (amplifikatsiooniks).
Tsükkel 1: mõlema ahela oligonukleotiidsed praimerid sünteesitakse in vitro eelnevalt teadaolevate nukleotiidsete järjestuste alusel. Tsükkel 2: PCR DNA-fragmendid sünteesitakse praimerite vahele jääva DNA ulatuses. Allikas: Geneetika (2012) lk. 328. |
Protsess on lühidalt järgmine: kuumutamise ja jahutamise vaheldumise abil paljundatakse (e. amplifitseeritakse) huvipakkuvat DNA-piirkonda.
Eristatakse kolme etappi:
1. denaturatsioon (näit. 92 - 95°C 30 sekundit) - kaheahelalise DNA ahelad eralduvad üheahelaliseks
2. praimerite hübridiseerimine DNA ahelatele (näit. 50 - 60°C 30 sekundit) komplementaarsuse alusel;
3. süntees (näit. 70 - 72°C 90 sekundit) - DNA-polümeraas seostub praimerijärjestusele ja lisab selle 3'-otsa nukleotiide, moodustub uus ahel.
Sellist järgnevust nimetatakse PCR-i tsükliks.
Animatsioon sellest meetodist avaneb lingilt.
Loomulikult on selles protsessis veel mitmeid tähtsaid komponente alates praimeritest ja lõpetades puhvrikomponentidega, kuid kõigisse detailidesse siinkohal ei süvene.
Oluline on meeles pidada, et PCR-s kasutatakse termostabiilseid DNA-polümeraase, seega PCR toimub alati DNA - ahelalt. (Näiteks qPCR e. RT-PCR puhul samuti, kuigi algmaterjaliks on RNA, siis vaid selleks, et RNA ahelalt DNA sünteesida ja sellelt PCR-i alustada.)
Mõnest DNA molekulist saadakse 30-40 tsükli jooksul miljardeid molekule.
PCR- meetodi tugevus on ka tema suureks puuduseks. Kuivõrd tegemist on ülitundliku meetodiga, siis võib süntees alata ka igalt juhuslikult molekulilt, mille järjestusele praimerid seonduvad ja proovide saastumine "võõra DNAga" on väga kerge juhtuma. Eriti tõenäoline on see konserveerunud praimerjärjestuste kasutamise või vähese lähtematerjali korral, samuti juhtudel, kus algmaterjaliga on kokku puutunud teised organismid. Taoliste juhtude kirjeldusi on teaduskirjandusest lihtne leida ja äpardusi juhtub ka kõige kogenenumatel uurijatel.
Sel lihtsal põhjusel tuleks laboriruumides algmaterjal, igasugused eraldamised ja muu ettevalmistav tegevus hoida kindlalt lahus tööst PCR-i reaktsiooni produktidega. Kummakski tegevuseks tuleks kasutada erinevaid pipetikomplekte, vajadusel ka filtriga pipetiotsikuid ning aeg-ajalt ruume ja töövahendeid UV-ga kiiritada või vastavate kemikaalidega puhastada.
Eristatakse kolme etappi:
1. denaturatsioon (näit. 92 - 95°C 30 sekundit) - kaheahelalise DNA ahelad eralduvad üheahelaliseks
2. praimerite hübridiseerimine DNA ahelatele (näit. 50 - 60°C 30 sekundit) komplementaarsuse alusel;
3. süntees (näit. 70 - 72°C 90 sekundit) - DNA-polümeraas seostub praimerijärjestusele ja lisab selle 3'-otsa nukleotiide, moodustub uus ahel.
Sellist järgnevust nimetatakse PCR-i tsükliks.
Animatsioon sellest meetodist avaneb lingilt.
Loomulikult on selles protsessis veel mitmeid tähtsaid komponente alates praimeritest ja lõpetades puhvrikomponentidega, kuid kõigisse detailidesse siinkohal ei süvene.
Oluline on meeles pidada, et PCR-s kasutatakse termostabiilseid DNA-polümeraase, seega PCR toimub alati DNA - ahelalt. (Näiteks qPCR e. RT-PCR puhul samuti, kuigi algmaterjaliks on RNA, siis vaid selleks, et RNA ahelalt DNA sünteesida ja sellelt PCR-i alustada.)
Mõnest DNA molekulist saadakse 30-40 tsükli jooksul miljardeid molekule.
PCR- meetodi tugevus on ka tema suureks puuduseks. Kuivõrd tegemist on ülitundliku meetodiga, siis võib süntees alata ka igalt juhuslikult molekulilt, mille järjestusele praimerid seonduvad ja proovide saastumine "võõra DNAga" on väga kerge juhtuma. Eriti tõenäoline on see konserveerunud praimerjärjestuste kasutamise või vähese lähtematerjali korral, samuti juhtudel, kus algmaterjaliga on kokku puutunud teised organismid. Taoliste juhtude kirjeldusi on teaduskirjandusest lihtne leida ja äpardusi juhtub ka kõige kogenenumatel uurijatel.
Sel lihtsal põhjusel tuleks laboriruumides algmaterjal, igasugused eraldamised ja muu ettevalmistav tegevus hoida kindlalt lahus tööst PCR-i reaktsiooni produktidega. Kummakski tegevuseks tuleks kasutada erinevaid pipetikomplekte, vajadusel ka filtriga pipetiotsikuid ning aeg-ajalt ruume ja töövahendeid UV-ga kiiritada või vastavate kemikaalidega puhastada.